Resumo. Os micro-organismos representam a maior diversidade biológica, química, molecular e fisiológica dos seres vivos, e o isolamento a partir de recursos naturais, como o solo, é de grande importância para a obtenção de novas linhagens. O objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar linhagens de fungos com potencial para a produção de β-galactosidase, com atividade de transgalactosilação. Foram coletadas amostras de solos, feitas diluições seriadas e inoculadas, em ágar Sabouraud modificado com lactose. Os fungos foram repicados até a obtenção de colônias isoladas e os micro-organismos selecionados foram identificados por cultivo entre lâmina e lamínula. O processo fermentativo para a produção da enzima foi feito no estado sólido com lactose a 1% (p/v) em frascos de cultura e mantido a 26 ºC por 7 dias. A β-galactosidase produzida foi parcialmente purificada com etanol e determinados os efeitos do pH e da temperatura na atividade enzimática, por meio de planejamento fatorial de dois níveis. A atividade de transgalactosilação foi avaliada, variando o pH e a concentração da enzima e o perfil dos carboidratos obtidos foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência. O fungo que expressou a maior atividade de β-galactosidase foi identificado como Penicillium sp e apresentou para a atividade enzimática os valores ótimos de pH e temperatura de 4,5 e 60 ºC, respectivamente. A β-galactosidase produzida pelo fungo Penicillium sp apresentou atividade hidrolítica e de transgalactosilação, tendo potencial para ser explorada industrialmente na produção de prebióticos. Palavras-chave: Fungos filamentosos. Fermentação no estado sólido. Galacto-oligossacarídeos, Transgalactosilação.