Resumo. A tecnologia de isolamento de protoplastos é uma importante ferramenta para estudos da bioquímica e fisiologia da membrana plasmática e regeneração da parede celular. Protoplastos de laranja “Caipira” (Citrus sinensis L. Osbeck) foram enzimaticamente isolados a partir de células em suspensão e posteriormente cultivados em meio líquido. Este trabalho teve por objetivo avaliar a viabilidade de protoplastos de laranja “Caipira” recém isolados por meio do corante Diacetato de Fluoresceína (FDA), em que se observou 95% de protoplastos fluorescendo. Por intermédio da técnica de microscopia eletrônica de varredura, observou-se protoplastos recém isolados da variedade laranja “Caipira”. Utilizou-se o corante Calcofluor White (CFW) para visualizar a parede celular regenerada em protoplastos com oito dias de cultivo da mesma variedade citada, em que se observou a presença de parede celular por meio de um anel azulado de intensa fluorescência. Palavras-chave: Protoplastos. Cultura de células. Microscopia de fluorescência e varredura. Citrus.