Resumo. Neste estudo avaliou-se as condições ideais para a produção in vitro de inóculo de Sclerotium rolfsii e Sclerotinia sclerotiorum. Quantificou-se, em placas de petri com meio de cultura artificial, a produção de esclerócios destes fungos sob diferentes regimes de temperatura, luminosidade e meios de cultura. Esta padronização é necessária quando se deseja produzir inóculo puro e em quantidade elevada, para testes de patogenicidade e de resistência de plantas à doenças. Os experimentos foram conduzidos sob condições controladas de laboratório em um delineamento inteiramente casualizado. Nos testes executados verificou-se que S. rolfsii desenvolveu-se melhor e produziu mais esclerócios em meio BDA (batata, dextrose, ágar) tradicional, a 27ºC e com 24 h de luz branca fluorescente. Todavia, S. sclerotiorum produziu mais esclerócios em BDA, a 21ºC com ou sem luz. Os meios PEGA (peptona, extrato de levedura, glucose e ágar), NA (nutriente ágar) e FA (fécula ou amido de batata, glucose e ágar) não induziram uma formação significativa de esclerócios.