Resumo. A produção de galactooligossacarídeos por fermentação sequencial de Penicillium sp e Bifidobacterium animalis subsp lactis usando farelo de trigo enriquecido com soro de leite foi investigada. A primeira etapa da fermentação sequencial foi conduzida somente com o Pencillium sp em concentração inicial de lactose de 40%. A segunda etapa iniciou após seis horas, com a inoculação da Bidobacterium animalis sub lactis. Foram avaliadas a conversão da lactose e a produção de oligossacarídeos por cromatografia líquida de alta eficiência. A enzima β-galactosidase apresentou atividade de transgalactosilação, sintetizando açúcares maiores que o substrato lactose, sendo estes considerados galactooligossacarídeos. Com o processo fermentativo sequencial após 12 horas, observou-se um aumento aproximado de 60% de área dos oligossacarídeos e a redução na concentração de glucose, mostrando que a síntese de oligossacarídeos foi inibida pela presença de glucose e que a ação da Bifidobacterium animalis sub lactis contribuiu positivamente para a eficiência do processo. Prolongando-se o tempo de fermentação sequencial para 96 horas, houve diminuição dos monossacarídeos sem alteração dos oligossacarídeos, caracterizando uma pré-purificação do prebiótico.  Palavras-chave: β-galactosidase. Galactooligossacarideos. Fermentação estado sólido.