Resumo. Uma alternativa viável para o controle biológico do pulgão do algodoeiro, Aphis gossypii, é a utilização de Bacillus thuringiensis. Recentemente, foi constatado que esta bactéria pode circular de forma sistêmica na planta, podendo ser utilizada no controle de insetos sugadores. Este trabalho teve como objetivos estabelecer uma metodologia de bioensaio seletivo de B. thuringiensis contra A. gossypii e selecionar estirpes potencialmente tóxicas a este inseto. A metodologia foi estabelecida utilizando uma estirpe de B. thuringiensis marcada com o gene gfp (“green fluorescence protein”), que permitiu a visualização da bactéria em um macerado do inseto alimentado da planta tratada com essa bactéria, através de microscopia ótica de fluorescência. Quatrocentas estirpes de B. thuringiensis pertencentes ao Banco de Germoplasma de Bacillus spp. da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia foram testadas através deste método de bioensaio e cinco delas (S29, S40, S616, S1168, e S1576) causaram mortalidade superior a 50%, sendo a estirpe S29 a melhor entre as testadas. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram a eficiência da metodologia, uma vez que através desta foi confirmado que B. thuringiensis tem ação tóxica contra o pulgão do algodoeiro, quando utilizado de forma sistêmica na planta de algodão.